Поворотным моментом для CRISPR в медицине становится не только умение «резать» генетический текст, но и способность вовремя остановиться. Команда из Мельбурна — исследователи Monash University и Университета Мельбурна — сообщила о создании искусственных «выключателей» для одной из ключевых ветвей CRISPR, системы Cas13, которая работает не с ДНК, а с РНК. В статье в Nature Chemical Biology ученые описывают, как с помощью алгоритмов дизайна белков они с нуля сконструировали компактные ингибиторы, способные подавлять активность Cas13 в бактериях и человеческих клетках; по оценке авторов, путь от выбора мишени до первых «хитов» занял около восьми недель.
Cas13 — важный инструмент нового поколения: он не «переписывает» геном, а управляет сообщениями, которые клетки читают с ДНК, то есть молекулами РНК. Это делает Cas13 привлекательным для задач, где нужно временно «приглушить» работу гена, вмешаться в вирусную РНК или построить чувствительные диагностические тесты. Но у такого инструмента есть та же проблема, что и у CRISPR в целом: активный фермент может задерживаться в клетке и срабатывать не там, где задумано. В клинике эта тема обостряется по мере роста числа реальных применений: от первых одобренных регуляторами терапий до прецедентов «персональной» генной коррекции.
Естественные «анти-CRISPR» — белки, которыми вирусы бактерий (бактериофаги) научились отключать бактериальную защиту, основанную на CRISPR, — давно рассматриваются как потенциальный механизм контроля. Но их мало, и поиск похож на разведку в темноте: приходится перебирать геномы, проверять кандидатов экспериментально, а затем еще и выяснять, подходят ли они конкретному «клинически интересному» ферменту. В релизе Monash University отмечается, что за последнее десятилетие исследователи описали лишь 118 анти-CRISPR-молекул, и «натуральные ингибиторы против практически важных целей» остаются редкостью.
Авторы новой работы пошли по другому пути: вместо поисков в природе они попытались спроектировать ингибиторы «с нуля» — de novo.
В качестве демонстрационной мишени выбрали хорошо изученный фермент LbuCas13a, для которого, как подчеркивает статья, не было известных природных ингибиторов. Логика была прагматичной: если удастся создать управляемый «рубильник» для Cas13, его можно будет использовать и как страховку (чтобы ограничивать побочные эффекты), и как исследовательский инструмент (чтобы точно дозировать вмешательство во времени).
Технически задача выглядела как прицельная блокировка «сердца» фермента — так называемого HEPN-домена, где происходит разрезание РНК. Исследователи задали алгоритмам конкретную геометрию цели: нужно было создать небольшой белок, который «закупорит» активный карман и перекроет доступ РНК-субстрату.
В итоге, используя RFdiffusion для генерации каркасов и ProteinMPNN для подбора аминокислотной последовательности, команда сгенерировала 10 000 вариантов и отобрала 96 кандидатов по набору вычислительных метрик.
Дальше началась проверка реальностью. Быстрый скрининг в бесклеточной системе показал, что десять из 96 конструкций снижают активность Cas13 более чем на 50% в тесте с флуоресцентным репортером; последующие измерения связывания и эксперименты с очищенными белками позволили выделить трех лидеров — A11, C10 и H8, которым дали имена AIcrVIA1–AIcrVIA3. Их «сила» оказалась на уровне, который в биохимии принято считать высоким сродством: концентрация, подавляющая активность наполовину (IC₅₀), лежала в низком наномолярном диапазоне, около ~7 нМ.
Одна из главных интриг таких проектов — совпадет ли нарисованная компьютером молекула с той, что получится в пробирке. Здесь исследователи подкрепили результаты структурной биологией: для AIcrVIA1 они получили рентгеноструктурные данные с разрешением 1,9 ангстрема и показали, что экспериментальная структура близка к предсказанию. А крио-ЭМ-картина комплекса Cas13 с ингибитором (3,55 ангстрема) позволила увидеть, как «выключатель» располагается в зоне HEPN-домена и контактирует с участками, на которые изначально нацеливали дизайн.
Важная деталь — воспроизводимость и доступность инструмента для других лабораторий. В статье указано, что структуры депонированы в Protein Data Bank, а плазмиды с AIcrVIA1–AIcrVIA3 переданы в Addgene, то есть новые ингибиторы можно относительно быстро взять в работу без повторения всего цикла разработки.
Это, по сути, переводит «выключатели CRISPR» из разряда редких находок в более инженерный, тиражируемый продукт — ровно то, что нужно индустрии, которая движется от лабораторных демонстраций к клиническим протоколам.
Сами авторы формулируют смысл работы максимально прикладно. «Используя ускоренный ИИ дизайн белков, мы быстро получили функциональные ингибиторы CRISPR, которые работают в бактериальных и человеческих клетках», — говорит ведущий автор и дизайнер белков Синтия Тавено. Руководитель группы Гэвин Нотт добавляет, что способность «создавать индивидуальные ингибиторы, удерживающие CRISPR „в рамках“», поможет развитию инструментария для исследований, медицины, сельского хозяйства и микробиологии.
Если подход окажется переносимым на другие версии Cas13 и на другие классы CRISPR-ферментов, он может заметно изменить экономику разработки: вместо многолетней охоты за природными анти-CRISPR появится более предсказуемая инженерная процедура, где «тормоза» проектируются вместе с «ускорителем». А для клиники это означает более тонкий контроль дозы и времени работы редактора — то есть потенциально более безопасный и управляемый инструментарий в момент, когда генная и РНК-инженерия начинают выходить за пределы узких показаний.
